顯色基質(zhì)鱟試劑盒操作方法！
用途：
顯色基質(zhì)鱟試劑( Chromogenic End-point TachypleusAmebocyte Lysate ， CE TAL )用于體外細(xì)
菌內(nèi)毒素的定量檢測，禁止以任何途徑進(jìn)入機(jī)體。
原理：
鱟試劑為鱟科動(dòng)物東方鱟的血液變形細(xì)胞溶解物的冷凍干燥品，鱟試劑中含有Ｃ因子、Ｂ因子、
凝固酶原、凝固蛋白原等。在適宜的條件下（溫度，pH值及無干擾物質(zhì)），細(xì)菌內(nèi)毒素激活C 因子，
引起一系列酶促反應(yīng)，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的顯色基質(zhì)，使其分解為多
肽和黃色的對硝基苯胺（pNA，λmax = 405nm） 。在一定時(shí)間內(nèi)，pNA的生成量與細(xì)菌內(nèi)毒素濃度成正相關(guān)，據(jù)此，可以定量供試品的內(nèi)毒素濃度。
同時(shí)，對硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化試劑染成玫瑰紅色（λmax = 545nm），避免了供試品本身
的顏色對405nm處吸收峰的干擾。
檢測限：
按反應(yīng)時(shí)間不同可檢測0.1EU/ml-1 EU/ml 和0.01EU/ml -0.1EU/ml 兩個(gè)區(qū)間( 反應(yīng)時(shí)間T 1 和T
2 見出廠檢驗(yàn)報(bào)告) 。
用法：
1. 材料和設(shè)備
1.1 試劑
鱟試劑、細(xì)菌內(nèi)毒素工作品、顯色基質(zhì)、偶氮化試劑1 、偶氮化試劑2 、偶氮化試劑3、HC l ( 反
應(yīng)終止劑) 、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。
1.2 器材
無熱原試管、無熱原吸頭、旋渦混合儀、移液器、多道移液器、封口膜、試管架、恒溫水浴箱
（37±1℃）、分光光度計(jì)。
注意：接觸試劑及供試品的所有器皿必須是無熱原的(我公司提供無熱原耗材)。
玻璃器皿可經(jīng) 250℃干烤至少 60 分鐘去除熱原。
2. 供試品的貯存與預(yù)處理
備注：若供試品為血液類，請參照我廠配套血液相關(guān)處理試劑使用說明書。
2.1 供試品的 pH 值應(yīng)在 6 - 8 之間，若超出此范圍，需用無熱原緩沖液、0.1N 氫氧化鈉或 0.1N 鹽酸
調(diào)節(jié)。
2.2 若供試品中可能存在鱟實(shí)驗(yàn)的干擾物質(zhì)，處理參見【供試品的干擾試驗(yàn)】。
2.3 若供試品中可能含有β－葡聚糖（β－葡聚糖會(huì)產(chǎn)生 G 因子旁路反應(yīng)，干擾內(nèi)毒素檢測），需選
用特異性鱟試劑（我公司提供）。
2.4 若供試品為一些抗菌塐如頭孢類抗菌塐和磺胺制劑會(huì)對偶氮染色劑產(chǎn)生偶聯(lián)反應(yīng)而干擾偶氮化
顯色，需要選用不含偶氮化試劑的試劑盒（我公司提供）。
2.5 若供試品的本底吸光度值大于 0.5，必須對供試品進(jìn)行稀釋后再檢測。
2.6 若供試品顏色較深(例如溶血)，或在酸性條件下顏色加深(例如一些組織培養(yǎng)介質(zhì))，必須設(shè)置供
試品空白管以扣除供試品自身的顏色本底。供試品空白管不加入鱟試劑，以等體積鱟試劑的溶
劑(該處為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水)代替。其余操作同供試品管。
實(shí)驗(yàn)操作
取無熱原試管，加入 100μl 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，或供試品。再加入 100μl 鱟
試劑溶液，混勻，37ºC 溫育 T1 分鐘。溫育結(jié)束，加入 100μl 顯色基質(zhì)溶液，混勻，37ºC 溫育 T2
分鐘。溫育結(jié)束，加入 500μl 偶氮化試劑 1 溶液，混勻，加入 500μl 偶氮化試劑 2 溶液，混勻加入
500μl 偶氮化試劑 3 溶液，混勻，靜置 5 分鐘，于 545nm 波長處讀取吸光度值。
干擾試驗(yàn)，步驟如下：
1. 選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或一個(gè)靠近中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度（設(shè)為λm），作為供試品干擾試驗(yàn)中添加的內(nèi)毒
素濃度，配制含λm 內(nèi)毒素的供試品陽性對照，測量出該溶液的內(nèi)毒素濃度，稱為 Cs；
2. 測量出未添加外源內(nèi)毒素的供試品溶液內(nèi)毒素濃度，稱為 Ct；
3. 計(jì)算該試驗(yàn)條件下的回收率 R＝（Cs–Ct）/λm×
4. 當(dāng) R 在 50%～200%之間，則認(rèn)為在此試驗(yàn)條件下供試品溶液不存在干擾作用。
5. 當(dāng) R 在 50%～200%之外，需對供試品進(jìn)行系列稀釋(稀釋倍數(shù)不得超過大有效稀釋倍數(shù) MVD)
或進(jìn)行其它處理消除干擾，每一稀釋溶液都重復(fù)步驟 1-3，直到內(nèi)毒素的回收率 R 在 50%～200%
之間。選擇回收率 R 接近 的稀釋倍數(shù)進(jìn)行內(nèi)毒素檢測。
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