1. 為什么做靶向測(cè)序
高通量測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用,特別是二代測(cè)序的普及,使得科研人員能夠更容易更快速地獲取基因組信息。然而,一方面,獲取完整基因組仍然費(fèi)用較高,特別是進(jìn)行大量樣本檢測(cè)時(shí)。另一方面,如何發(fā)掘隱藏在海量測(cè)序數(shù)據(jù)背后的意義仍是短期內(nèi)無法解決的問題。所以現(xiàn)在就說,我們進(jìn)入了個(gè)人基因組時(shí)代還為時(shí)尚早。
在研究中,大多數(shù)的科研人員其實(shí)并不需要全部的基因組序列,也難以有效利用如此巨大的數(shù)據(jù)集??蒲腥藛T在很多情況下更需要高度的分析,例如檢測(cè)罕見疾病攜帶的變異,或是確保檢測(cè)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。此外,在的醫(yī)學(xué)中,當(dāng)人們只關(guān)注特定的基因或基因組區(qū)域時(shí),受時(shí)間、費(fèi)用和數(shù)據(jù)存儲(chǔ)等因素限制,對(duì)特定基因集(幾十到幾百個(gè)熱點(diǎn)基因)或是基因組的特定區(qū)域進(jìn)行測(cè)序是更為合理的選擇。這種測(cè)序策略即為靶向測(cè)序。靶向測(cè)序能更經(jīng)濟(jì)地實(shí)現(xiàn)大量樣本的檢測(cè),實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)高于基因組測(cè)序的測(cè)序深度和靈敏度,并且大幅提升突變發(fā)現(xiàn)能力。
2. 靶標(biāo)捕獲可以更簡(jiǎn)單嗎
目前主流的靶向序列捕獲方案主要有兩種,一種基于雜交靶向富集,另一種基于多重PCR靶向富集。現(xiàn)有的靶向文庫(kù)制備方法都不同程度的存在著均一性差、序列脫靶、操作流程繁復(fù)、操作時(shí)間長(zhǎng)以及高昂的前期設(shè)備投入等問題。有沒有新的技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)更簡(jiǎn)單的靶向文庫(kù)制備,又能獲取更高特異性和均一性的文庫(kù)?是不是能一次反應(yīng)就能同時(shí)完成靶向序列的捕獲和測(cè)序文庫(kù)的制備,而不需要額外的實(shí)驗(yàn)操作?
答案是肯定的。zui近上市的VariantPro™靶向文庫(kù)制備系統(tǒng),是一個(gè)基于多重PCR又不同于傳統(tǒng)多重PCR的靶向文庫(kù)制備技術(shù),這個(gè)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了一步操作即完成從靶向序列捕獲到測(cè)序文庫(kù)制備的全過程,而整個(gè)過程中只需人工操作5分鐘。這個(gè)新系統(tǒng)采用了兩項(xiàng)技術(shù):OmegaPrimer™和RelayPCR™。這兩項(xiàng)技術(shù)又有什么過人之處?
3. *的形似Ω的引物
OmegaPrimer™是一個(gè)*不同于傳統(tǒng)的,形似Ω的*引物。這個(gè)引物帶有3個(gè)功能區(qū),5p臂設(shè)計(jì)保證了引物穩(wěn)定的結(jié)合模板,3p臂設(shè)計(jì)會(huì)雙重檢查結(jié)合特異性并啟動(dòng)聚合酶延伸,兩臂之間的loop環(huán)起到間隔作用,同時(shí)又為后續(xù)文庫(kù)擴(kuò)增提供通用引物(common primer)雜交的序列(圖1)。在OmegaPrimer™中3p臂被設(shè)計(jì)較短,因而在統(tǒng)計(jì)學(xué)上,將大幅降低多重PCR體系中形成可擴(kuò)增引物二聚體幾率。這樣的設(shè)計(jì)大幅提升了引物的特異性,同時(shí)又能容忍模板出現(xiàn)個(gè)別堿基的突變。容忍模板出現(xiàn)個(gè)別堿基的突變有什么用處?這是一個(gè)非常有用的特性,考慮到在擁有30億個(gè)堿基對(duì)的人類基因組中有600萬個(gè)高等位基因頻率(> 1%)的SNPs,平均每500 bp就有1個(gè)SNP,這樣的引物寬容性就顯得非常必要了。
圖1 OmegaPrimer™含有3個(gè)功能區(qū)
4. 會(huì)自動(dòng)接力的PCR
RelayPCR™(接力PCR)將一對(duì)通用引物和成百上千對(duì)(甚至更多)特異性引物(OmegaPrimer™)與基因組DNA混合在一個(gè)樣品管中。運(yùn)行一次多重PCR即完成從特異性捕獲成百上千個(gè)靶向序列(區(qū)域)到高均一性制備測(cè)序文庫(kù)的全過程。這個(gè)設(shè)計(jì)帶來顯著簡(jiǎn)化的工作流程。具體地,RelayPCR™可以通過控制成百上千對(duì)特異性引物(OmegaPrimer™)只在zui初靶標(biāo)捕獲的兩個(gè)循環(huán)中發(fā)揮作用,之后會(huì)自動(dòng)轉(zhuǎn)換到由一對(duì)通用引物(common primer)進(jìn)行的文庫(kù)擴(kuò)增反應(yīng)。這種實(shí)驗(yàn)策略消除了傳統(tǒng)多重PCR中多對(duì)特異性引物間存在的引物擴(kuò)增效率差異的現(xiàn)象,從而確保了制備高均一性文庫(kù)(圖2)。在設(shè)計(jì)通用引物時(shí),可以引入二代測(cè)序所需的引物(包括barcode),并且兼容主流的illumina和Ion Torrent測(cè)序平臺(tái)。當(dāng)全部PCR反應(yīng)結(jié)束后,測(cè)序文庫(kù)也一起制備完畢。
圖2 RelayPCR™實(shí)驗(yàn)流程
由于反應(yīng)體系中common primer的量遠(yuǎn)大于specific primer(即omegaprimer™)的量,zui初靶標(biāo)捕獲的兩個(gè)循環(huán)結(jié)束后,體系中出現(xiàn)了可與common primer雜交的擴(kuò)增子時(shí),PCR反應(yīng)即自動(dòng)切換到由一對(duì)common primer引導(dǎo)的文庫(kù)擴(kuò)增階段。與common primer雜交結(jié)合的序列,來自omegaprimer™的loop環(huán)。
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5. VariantPro™表現(xiàn)如何
? *的文庫(kù)均一性
由于VariantPro™采用了Relay-PCR™技術(shù),限制特異性引物(OmegaPrimer™)只在zui初2個(gè)循環(huán)——靶標(biāo)捕獲時(shí)發(fā)揮作用,接著會(huì)自動(dòng)切換到由通用引物主導(dǎo)的文庫(kù)擴(kuò)增循環(huán),直到反應(yīng)結(jié)束,從而確保了生成*均一性的文庫(kù)(見圖3)。
擴(kuò)增子覆蓋的均一性通常是由>0.2×擴(kuò)增子平均覆蓋度的序列所占百分比來測(cè)定。如下圖所示,VariantPro™系統(tǒng)制備的人類線粒體DNA文庫(kù)達(dá)到> 99.1%的均一性。
圖3 VariantPro™系統(tǒng)制備文庫(kù)具有*的文庫(kù)均一性
? *的重復(fù)性
樣品和文庫(kù)制備步驟中的誤差是破壞實(shí)驗(yàn)重復(fù)性的一個(gè)潛在來源。這意味著實(shí)驗(yàn)越復(fù)雜就越可能增加實(shí)驗(yàn)誤差的幾率。VariantPro™具有極簡(jiǎn)的工作流程,因而zui大限度地降低操作引起的誤差。測(cè)試實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),運(yùn)行不同的PCR循環(huán)數(shù)或采用不同的起始DNA量,都不會(huì)顯著影響測(cè)序結(jié)果的重復(fù)性(見圖4,5)。
| 15 cycles | 17 cycles | 19 cycles | 21 cycles | 23 cycles | 27 cycles |
15 cycles | 1.000 | 0.992 | 0.983 | 0.951 | 0.978 | 0.932 |
17 cycles | 0.992 | 1.000 | 0.995 | 0.969 | 0.984 | 0.919 |
19 cycles | 0.983 | 0.995 | 1.000 | 0.965 | 0.980 | 0.910 |
21 cycles | 0.951 | 0.969 | 0.965 | 1.000 | 0.973 | 0.890 |
23 cycles | 0.978 | 0.984 | 0.980 | 0.973 | 1.000 | 0.944 |
27 cycles | 0.932 | 0.919 | 0.910 | 0.890 | 0.944 | 1.000 |
圖4 不同PCR循環(huán)次數(shù)(15至27個(gè)循環(huán))的相關(guān)系數(shù)分析表明,PCR循環(huán)次數(shù)不會(huì)影響文庫(kù)組成。
| 1.0 ng | 2.5 ng | 5.0 ng | 7.5 ng | 10.0 ng |
1.0 ng | 1.000 | 0.991 | 0.986 | 0.978 | 0.952 |
2.5 ng | 0.991 | 1.000 | 0.979 | 0.989 | 0.973 |
5.0 ng | 0.986 | 0.979 | 1.000 | 0.984 | 0.956 |
7.5 ng | 0.978 | 0.989 | 0.984 | 1.000 | 0.984 |
10.0 ng | 0.952 | 0.973 | 0.956 | 0.984 | 1.000 |
圖5 不同的模板gDNA(1.0至10.0 ng)的相關(guān)系數(shù)分析表明,反應(yīng)所需模板量是靈活可變的。
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