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南京信帆生物:One-Step靶向文庫(kù)制備是怎樣煉成的?
更新時(shí)間:2016-05-15   點(diǎn)擊次數(shù):1537次

1. 為什么做靶向測(cè)序

高通量測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用,特別是二代測(cè)序的普及,使得科研人員能夠更容易更快速地獲取基因組信息。然而,一方面,獲取完整基因組仍然費(fèi)用較高,特別是進(jìn)行大量樣本檢測(cè)時(shí)。另一方面,如何發(fā)掘隱藏在海量測(cè)序數(shù)據(jù)背后的意義仍是短期內(nèi)無法解決的問題。所以現(xiàn)在就說,我們進(jìn)入了個(gè)人基因組時(shí)代還為時(shí)尚早。

在研究中,大多數(shù)的科研人員其實(shí)并不需要全部的基因組序列,也難以有效利用如此巨大的數(shù)據(jù)集??蒲腥藛T在很多情況下更需要高度的分析,例如檢測(cè)罕見疾病攜帶的變異,或是確保檢測(cè)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。此外,在的醫(yī)學(xué)中,當(dāng)人們只關(guān)注特定的基因或基因組區(qū)域時(shí),受時(shí)間、費(fèi)用和數(shù)據(jù)存儲(chǔ)等因素限制,對(duì)特定基因集(幾十到幾百個(gè)熱點(diǎn)基因)或是基因組的特定區(qū)域進(jìn)行測(cè)序是更為合理的選擇。這種測(cè)序策略即為靶向測(cè)序。靶向測(cè)序能更經(jīng)濟(jì)地實(shí)現(xiàn)大量樣本的檢測(cè),實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)高于基因組測(cè)序的測(cè)序深度和靈敏度,并且大幅提升突變發(fā)現(xiàn)能力。

2. 靶標(biāo)捕獲可以更簡(jiǎn)單嗎

目前主流的靶向序列捕獲方案主要有兩種,一種基于雜交靶向富集,另一種基于多重PCR靶向富集。現(xiàn)有的靶向文庫(kù)制備方法都不同程度的存在著均一性差、序列脫靶、操作流程繁復(fù)、操作時(shí)間長(zhǎng)以及高昂的前期設(shè)備投入等問題。有沒有新的技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)更簡(jiǎn)單的靶向文庫(kù)制備,又能獲取更高特異性和均一性的文庫(kù)?是不是能一次反應(yīng)就能同時(shí)完成靶向序列的捕獲和測(cè)序文庫(kù)的制備,而不需要額外的實(shí)驗(yàn)操作?

答案是肯定的。zui近上市的VariantPro™靶向文庫(kù)制備系統(tǒng),是一個(gè)基于多重PCR又不同于傳統(tǒng)多重PCR的靶向文庫(kù)制備技術(shù),這個(gè)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了一步操作即完成從靶向序列捕獲到測(cè)序文庫(kù)制備的全過程,而整個(gè)過程中只需人工操作5分鐘。這個(gè)新系統(tǒng)采用了兩項(xiàng)技術(shù):OmegaPrimer™和RelayPCR™。這兩項(xiàng)技術(shù)又有什么過人之處?

3. *的形似Ω的引物

OmegaPrimer™是一個(gè)*不同于傳統(tǒng)的,形似Ω的*引物。這個(gè)引物帶有3個(gè)功能區(qū),5p臂設(shè)計(jì)保證了引物穩(wěn)定的結(jié)合模板,3p臂設(shè)計(jì)會(huì)雙重檢查結(jié)合特異性并啟動(dòng)聚合酶延伸,兩臂之間的loop環(huán)起到間隔作用,同時(shí)又為后續(xù)文庫(kù)擴(kuò)增提供通用引物(common primer)雜交的序列(圖1)。在OmegaPrimer™中3p臂被設(shè)計(jì)較短,因而在統(tǒng)計(jì)學(xué)上,將大幅降低多重PCR體系中形成可擴(kuò)增引物二聚體幾率。這樣的設(shè)計(jì)大幅提升了引物的特異性,同時(shí)又能容忍模板出現(xiàn)個(gè)別堿基的突變。容忍模板出現(xiàn)個(gè)別堿基的突變有什么用處?這是一個(gè)非常有用的特性,考慮到在擁有30億個(gè)堿基對(duì)的人類基因組中有600萬個(gè)高等位基因頻率(> 1%)的SNPs,平均每500 bp就有1個(gè)SNP,這樣的引物寬容性就顯得非常必要了。


 
圖1 OmegaPrimer™含有3個(gè)功能區(qū)

4. 會(huì)自動(dòng)接力的PCR

RelayPCR™(接力PCR)將一對(duì)通用引物和成百上千對(duì)(甚至更多)特異性引物(OmegaPrimer™)與基因組DNA混合在一個(gè)樣品管中。運(yùn)行一次多重PCR即完成從特異性捕獲成百上千個(gè)靶向序列(區(qū)域)到高均一性制備測(cè)序文庫(kù)的全過程。這個(gè)設(shè)計(jì)帶來顯著簡(jiǎn)化的工作流程。具體地,RelayPCR™可以通過控制成百上千對(duì)特異性引物(OmegaPrimer™)只在zui初靶標(biāo)捕獲的兩個(gè)循環(huán)中發(fā)揮作用,之后會(huì)自動(dòng)轉(zhuǎn)換到由一對(duì)通用引物(common primer)進(jìn)行的文庫(kù)擴(kuò)增反應(yīng)。這種實(shí)驗(yàn)策略消除了傳統(tǒng)多重PCR中多對(duì)特異性引物間存在的引物擴(kuò)增效率差異的現(xiàn)象,從而確保了制備高均一性文庫(kù)(圖2)。在設(shè)計(jì)通用引物時(shí),可以引入二代測(cè)序所需的引物(包括barcode),并且兼容主流的illumina和Ion Torrent測(cè)序平臺(tái)。當(dāng)全部PCR反應(yīng)結(jié)束后,測(cè)序文庫(kù)也一起制備完畢。


 
圖2 RelayPCR™實(shí)驗(yàn)流程

由于反應(yīng)體系中common primer的量遠(yuǎn)大于specific primer(即omegaprimer™)的量,zui初靶標(biāo)捕獲的兩個(gè)循環(huán)結(jié)束后,體系中出現(xiàn)了可與common primer雜交的擴(kuò)增子時(shí),PCR反應(yīng)即自動(dòng)切換到由一對(duì)common primer引導(dǎo)的文庫(kù)擴(kuò)增階段。與common primer雜交結(jié)合的序列,來自omegaprimer™的loop環(huán)。

點(diǎn)擊觀看微電影《一步法制備靶向測(cè)序文庫(kù)》

5. VariantPro™表現(xiàn)如何

? *的文庫(kù)均一性
由于VariantPro™采用了Relay-PCR™技術(shù),限制特異性引物(OmegaPrimer™)只在zui初2個(gè)循環(huán)——靶標(biāo)捕獲時(shí)發(fā)揮作用,接著會(huì)自動(dòng)切換到由通用引物主導(dǎo)的文庫(kù)擴(kuò)增循環(huán),直到反應(yīng)結(jié)束,從而確保了生成*均一性的文庫(kù)(見圖3)。

擴(kuò)增子覆蓋的均一性通常是由>0.2×擴(kuò)增子平均覆蓋度的序列所占百分比來測(cè)定。如下圖所示,VariantPro™系統(tǒng)制備的人類線粒體DNA文庫(kù)達(dá)到> 99.1%的均一性。


 
圖3 VariantPro™系統(tǒng)制備文庫(kù)具有*的文庫(kù)均一性

? *的重復(fù)性
樣品和文庫(kù)制備步驟中的誤差是破壞實(shí)驗(yàn)重復(fù)性的一個(gè)潛在來源。這意味著實(shí)驗(yàn)越復(fù)雜就越可能增加實(shí)驗(yàn)誤差的幾率。VariantPro™具有極簡(jiǎn)的工作流程,因而zui大限度地降低操作引起的誤差。測(cè)試實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),運(yùn)行不同的PCR循環(huán)數(shù)或采用不同的起始DNA量,都不會(huì)顯著影響測(cè)序結(jié)果的重復(fù)性(見圖4,5)。

 

 

15 cycles

17 cycles

19 cycles

21 cycles

23 cycles

27 cycles

 15 cycles

1.000

0.992

0.983

0.951

0.978

0.932

17 cycles

0.992

1.000

0.995

0.969

0.984

0.919

19 cycles

0.983

0.995

1.000

0.965

0.980

0.910

21 cycles

0.951

0.969

0.965

1.000

0.973

0.890

23 cycles

0.978

0.984

0.980

0.973

1.000

0.944

27 cycles

0.932

0.919

0.910

0.890

0.944

1.000

 

圖4 不同PCR循環(huán)次數(shù)(15至27個(gè)循環(huán))的相關(guān)系數(shù)分析表明,PCR循環(huán)次數(shù)不會(huì)影響文庫(kù)組成。

 

1.0 ng

2.5 ng

5.0 ng

7.5 ng

10.0 ng

1.0 ng

1.000

0.991

0.986

0.978

0.952

2.5 ng

0.991

1.000

0.979

0.989

0.973

5.0 ng

0.986

0.979

1.000

0.984

0.956

7.5 ng

0.978

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0.984

10.0 ng

0.952

0.973

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0.984

1.000

圖5 不同的模板gDNA(1.0至10.0 ng)的相關(guān)系數(shù)分析表明,反應(yīng)所需模板量是靈活可變的。

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